谢文丽 刘文玲 胡大一 崔炜 朱天刚 李翠兰 孙艺红 李蕾 李田昌 边红 仝其广
作者单位：100044 北京大学人民医院心内科［谢文丽（现在河北医科大学第二医院心内科）、刘文玲、胡大一、朱天刚、李翠兰、孙艺红、李蕾］；河北医科大学第二医院心内科（崔炜）；首都医科大学同仁医院心脏中心（李田昌、边红、仝其广）
【摘要】 目的 研究中国人家族性肥厚型心肌病(HCM)的致病基因突变位点，分析基因型与临床表型的相互关系。方法 对5个家族性HCM的先证者进行β-肌球蛋白重链基因(β-MHC)扫描，聚合酶链反应（PCR）扩增其功能区外显子片段，双脱氧末端终止法测序。对阳性测序结果者进行家系中其他成员筛查，并分析患者临床表型特点。结果 在其中2个家系中分别发现R663H、E924K杂合突变，而正常对照组同一位置未见异常，E924K在我国HCM患者中首次发现。结论 β-MHC为我国家族性HCM的致病基因之一。其临床表型的异质性提示多因素参与了HCM的发生及外显。
【关键词】 心肌病，肥大性； 肌球蛋白重链； 突变
肥厚型心肌病(HCM)是一种与遗传有关的疾病，属常染色体显性遗传，约55%有家族史［1］。Solomon等［2］1990年首次报告白种人HCM家系患者的致病基因之一位于14号染色体长臂，与心脏肌球蛋白重链基因（myosin heavy chain, MHC）紧密连锁。随后一些学者相继在不同种族的HCM 患者中发现心脏β-肌球蛋白重链（β-MHC，MYH7）基因存在多种错义突变，这些突变与心肌肥厚的发生密切相关［3，4］。也有报道发现HCM患者的致病基因分别位于1、2、3、7、11、12、15、19号染色体［5，6］，显示该病的遗传异质性。目前，已经明确发现10个心脏肌节蛋白基因的致病突变，但资料显示β-肌球蛋白重链（β-MHC，MYH7）基因突变所致的HCM约占病例总数的30%~50% ［7，8］。β-MHC基因全长23 kb，有40个外显子，其中38个外显子编码了1935个氨基酸。目前国内外已经报道了80多个单碱基突变导致β-MHC基因球头区、球杆连接区部位的氨基酸改变，从而导致HCM的系列临床表现。我们以MYH7为候选基因，对5个家族性HCM家系先证者的基因组DNA进行直接测序，以研究中国人家族性HCM的发病基因及突变位点。
对象与方法
一、对象
5个无血缘关系的汉族家族性HCM家系，分别来自河南、黑龙江、湖南、安徽、北京。5例先证者男2例，女3例，年龄11~59岁，均为汉族。18例散发的HCM患者（男12 例，女 6例，年龄23~87岁，平均55岁±15岁，均为汉族）。患者均经二维及多普勒超声心动图及心电图诊断为HCM，家族性HCM的患者其家族中至少2人以上发病。临床资料包括体检、心电图、二维及多普勒超声心动图检查。HCM患者诊断标准：超声心动图检查室间隔或心室壁厚度≥13 mm, 排除其他可能引起心肌肥厚的心血管疾病和全身疾病（诊断依据WHO/ISFC 1996年公布标准）。对照组为80名健康志愿者（均为汉族，男47例，女33例，年龄20~71岁，平均56岁±14岁），各项检查均未见异常。
二、方法
1. 基因组DNA提取：取外周静脉血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，盐析法从白细胞中提取基因组DNA。
2. PCR扩增家族性HCM先证者基因组DNA：据文献报道设计MYH7的3~27及40外显子含侧翼内含子序列的引物［9］。由北京奥科生物技术有限公司合成引物，其中18外显子引物序列为:上游5′CATCTCTGTGACTTCTCGAATTCT 3′，下游5′CACTGTGGTGGTAGGTAGGGAGAT 3′; 23外显子引物序列为：上游5′ TCCTATTTGAGTGATGTGCCT-CTC3′,下游5′ATGGTCTGAGAGTCCTGATGAGAC 3′。 PCR扩增体系40 μl，反应体系含基因组DNA 250 ng，双向引物9 pmol, dNTP 160 μmol，10×缓冲液4 μl，Taq DNA聚合酶2 U（鼎国生物技术公司）。扩增条件：95℃预变性5 min； 95℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s， 共35个循环；72℃延伸10 min。(PTC-200型PCR仪为美国MJ RESEARCH公司产品)。
3. PCR产物测序并分析：将所扩增外显子的PCR产物均按双脱氧末端终止法进行测序反应(美国ABI公司3730XL测序仪)，测序引物与PCR引物相同。
4. 应用18及23外显子的引物序列扩增：(1)扩增2个家系中其他成员的DNA目的片段（无论是否诊断为HCM），PCR产物按双脱氧末端终止法进行测序反应；（2）扩增临床诊断为HCM，但无家族病史的18例散发患者的DNA目的片段，并测序；（3）扩增80名健康志愿者的DNA目的片段，并测序。
5. 变性位点的确定：应用Vector NTI 7.0分析软件分析测序结果，并与GenBank中的标准序列进行对比，确定可能的突变位点。
结 果
1 .突变家系图及先证者资料： 2个具有阳性测序结果的家系资料见图1。其余3个家系的先证者未发现MYH7基因突变。
家系1的先证者Ⅱ-2，男，33岁发病，诊断为梗阻型心肌病，以活动后头晕、心悸，胸痛，严重时有黑矇发作，心前区听诊可闻及粗糙响亮的收缩期杂音。超声提示：室间隔厚度为22.6 mm，左室后壁的厚度9.9 mm。其父亲Ⅰ-1，48岁时在剧烈运动后猝死；其弟Ⅱ-5为基因携带者，临床无症状，无体征，超声也无异常。家族中其他人均正常。
家系2的先证者为Ⅲ-10，女，21岁，16岁发病，诊断为肥厚梗阻性心肌病，临床以活动后胸闷、气短为主，逐渐发展为不能平卧，无胸痛及黑矇。超声提示：室间隔厚度为22.5 mm，左室后壁厚度8.4 mm。其父Ⅱ-8， 25岁时因该病猝死；其姑母Ⅱ-1，20岁时因该病猝死。家族中11人患病，除猝死的两人未获得超声资料外，其他9人超声检查迥异，有的为梗阻性，有的为非梗阻性，有的以室间隔增厚为主，有的弥漫性左室壁增厚。
2.β-MHC基因突变分析，测序结果： 在2个家系的先证者中，分别发现2个致病突变。家系1先证者为18号外显子发生G12601A突变，氨基酸改变，即R663H(图2)。家系2先证者为23号外显子发生G15373A突变，氨基酸改变，即E924K。
3.应用18号外显子及23号外显子的引物序列，扩增其各自家系中其他成员（无论是否患病）DNA:家系1中健在的其他人员除先证者之弟Ⅱ-5携带该突变外，余未见相同突变；家系2中所有临床诊断HCM的患者均在23号外显子的同一位点发生相同突变，而家系中正常人均未发现该位点突变。散发的18例患者及80名对照中均未发现R663H、E924K突变。
讨 论
近年来人们对HCM病理生理和治疗的认识有了很大进步。本病的特征为患者左室壁肥厚，但没有其他可引起心肌肥厚的因素。一般人群发病率为0.2%［10］，但这一数值可能比实际发病率偏低，因为许多患者可能因没有临床症状而未被诊断。心肌肥厚常常伴随左室流出道的血流动力学障碍，左室充盈和舒张功能异常以及运动诱发的心肌灌注不良。患者常有严重症状，易发生房性、室性心率失常以及猝死［11，12］。
肌球蛋白有3个功能区：头、颈和尾（或杆）。肌球蛋白头部有一个三磷酸腺苷结合袋（ATP cleft）和一个肌动蛋白结合点。肌球蛋白通过颈部的伸展与肌动蛋白发生作用，其尾部用来固定分子。大多数β-肌球蛋白突变表现为疾病几乎完全外显并且猝死率高，只有少数β-肌球蛋白突变疾病外显率低，且预后较好［11］。R663H位于头颈部的肌动蛋白连接区。E924K位于杆部，这一部位与肌球连接蛋白-C (MyBP-C)相连接，突变导致连接的稳固性减低，影响了β-MHC与MyBP-C的相互作用［11-13］。
HCM的临床表现多样，并且在同一家族内部的不同患病个体，其发病情况及临床表现也不相同，提示多种因素参与了HCM的发生与发展过程。相同的致病突变，不同的遗传背景，以及环境因素可能是造成临床表型差异的主要因素［14］，其中编码肾素-血管紧张素-醛固酮系统一系列基因的多态性可能是影响其临床表现的重要因素之一［15］。左室肥厚呈多种多样的临床表现（即使相同的基因突变也如此），与肌小节无直接联系，这也反映了调节因素的重要性［14］。
R663H突变国内曾有报道［16］，有学者认为此位点可能为我国汉族人群的多发位点，且预后较好，外显率较低。而本研究发现该位点也可引起猝死（家系1中Ⅰ-1）。E924K突变则是首次在我国人群发现，家系2资料表明，该位点在这一家系外显率高（100%），发病早(家系2中Ⅳ-1发病年龄6岁，Ⅲ-10发病年龄16岁)，预后差（Ⅱ-1和Ⅱ-8分别在20岁和25岁发生猝死，Ⅱ-2在52岁出现重度心力衰竭、房颤及卒中）。E924K突变最早由美国哈佛医学院报告，为1例散发病例，其父母基因学筛查均阴性，但其突变可向后代传递，并且其临床表现与子代迥异［17］。而2003年瑞典报告的E924K突变则是一个HCM家系［18］。
在本研究5个家族性HCM中，发现2个家系为β-MHC基因的突变，另外3个家系未发现β-MHC基因突变，反应了HCM的遗传异质性。同时，有限的资料提示，23号外显子突变的家系2外显率较高，而18号外显子突变的家系1外显率则较低，与国内报道的有关18号外显子的家系结果相似［16］。23号外显子突变者不仅外显率高，而且发病早，预后差，同一家系中表现型也各不相同，反映了HCM 临床表现型的异质性。本研究在5个中国北方汉族家族性HCM中，筛选出2个家系为MYH7基因突变，占40％，与国外资料报道的30％~50％一致。
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